Índice
Incluido en la revista Ocronos. Vol. IV. Nº 3–Marzo 2021. Pág. Inicial: Vol. IV; nº3: 132
Autor principal (primer firmante): Natalia Antomil Antuña
Fecha recepción: 25 de Febrero, 2021
Fecha aceptación: 20 de Marzo, 2021
Ref.: Ocronos. 2021;4(3): 132
Autoras:
Natalia Antomil Antuña 1, Eva María Fanjul Pasarín 2.
- Técnico Especialista en Laboratorio de Diagnóstico Clínico, Hospital Central de Asturias, Oviedo – España.
- Técnico Especialista en Laboratorio de Diagnóstico Clínico, Clinix, Avilés – España.
Palabras clave: citoquímica, tinción, hemopatía.
Introducción
La citoquímica estudia la composición química de la célula y permite detectar la localización topográfica de algunos principios inmediatos, enzimas, metales pesados y otras sustancias. Se considera como un nexo de unión entre la morfología y la bioquímica.
Las técnicas citoquímicas son un complemento de las tinciones hematológicas, y por medio de ellas se localizan enzimas y sustancias inorgánicas, mejorando así la diferenciación celular y en algunos casos también sirven para el diagnóstico de ciertas leucemias.
Los componentes celulares que son posibles revelar con el estudio citoquímico son:
- Enzimas (oxidantes e hidrolíticas)
- Glucógeno
- Lípidos
Entre las enzimas oxidantes se encuentra la peroxidasa leucocitaria. Entre las enzimas hidrolíticas (hidrolasas) se encuentran entre otras las fosfatasas ácidas, fosfatasas alcalinas, esterasas específicas y no específicas.
Tipos de tinción y utilidad de las mismas
PAS
La reacción de PAS o del ácido peryódico de Schiff se basa en la rotura de los enlaces -C-C- presentes en los carbohidratos por la acción del ácido peryódico, potente agente oxidante, liberándose grupos aldehído que al combinarse con el reactivo de Schiff dan un compuesto de color rojo púrpura intenso. Identifica al glucógeno en el citoplasma celular.
La reacción del PAS ha perdido utilidad en el diagnóstico hematológico después de la aparición de mejores marcadores. Sigue teniendo interés en la diferenciación de diferentes tipos de leucemias linfoblásticas, en la eritroleucemia y en diversas mielodisplasias.
Negro B de Sudán
Es una coloración no enzimática útil en patología mieloide. Tiñe los fosfolípidos y otros lípidos, colorea los gránulos azurófilos y específicos de los granulocitos y tiene la ventaja de que con el tiempo no disminuye la actividad. Los neutrófilos segmentados y sus precursores muestran unos gránulos gruesos en el citoplasma de color gris muy oscuro.
Peroxidasa
La demostración citoquímica de esta enzima se basa en la acción oxidante de la peroxidasa sobre el substrato, bencidina, en presencia de peróxido de hidrógeno, apareciendo un precipitado amarillo ocre en el lugar del citoplasma en donde se ha producido la reacción.
La mieloperoxidasa se sintetiza en el retículo endoplasmático rugoso, de donde pasa a las cisternas del aparato de Golgi quedando localizada fundamentalmente en la granulación 1ª o azurófila. Se localiza, sobre todo, en los gránulos primarios de los neutrófilos y precursores, así como en los gránulos de los eosinófilos y monocitos.
Dicha enzima se combina in vivo con peróxido de hidrógeno transformándose en un potente agente bactericida, viricida y fungicida.
La aplicación fundamental de la mieloperoxidasa se refiere a la capacidad discriminatoria entre celularidad blástica mieloide y linfoide, ya que los mieloblastos muy precoces sin estigmas de diferenciación mieloide ya pueden ser mieloperoxidasa positivos.
Un déficit de mieloperoxidasa en los polimorfonucleares (PMN) maduros, excepto en el caso de que se trate de una deficiencia congénita, debe interpretarse como un signo disgranulopoyético.
Fosfatasa alcalina
La fosfatasa alcalina es una hidrolasa perteneciente al grupo de las fosfomonoesterasas; hidroliza monoésteres del ácido fosfórico, actuando a un pH de 9,1 a 9,6; ligeros ¯ de pH determinan una rápida inactivación de la enzima. La demostración citoquímica se basa en la hidrólisis de ciertos substratos, de los cuales se liberan unos productos intermedios que combinados con una sal diazoica dan un precipitado coloreado.
La actividad de la fosfatasa alcalina granulocítica se manifiesta en forma de un precipitado pardo negruzco localizado en el citoplasma. Se encuentra actividad fosfatasa alcalina en algunas células maduras y semimaduras de la granulopoyesis neutrófila (bandas y segmentados).
No todos los granulocitos presentan el mismo grado de positividad; en función de este dato se establece un índice de actividad de fosfatasa alcalina. Se pueden distinguir tres tipos de reacción:
- grado 0: sin actividad enzimática.
- grado I: con cierta actividad enzimática en forma granular única o actividad débil difusa en una parte del citoplasma, especialmente en la zona perinuclear.
- grado II: intensa actividad granular o actividad difusa distribuida por todo el citoplasma granulocítico.
Se realiza un recuento sobre 100 granulocitos asignando a cada uno un grado; y a cada grado se la asocia un valor: grado 0=0, grado I=1, grado II=2. Se suman los valores y el número obtenido es el índice de FAG, que tiene un valor mínimo de 0 y máximo de 200. El índice normal oscila entre 20 y 40.
Su máximo interés se centra en el estudio de los síndromes mieloproliferativos, sobre todo para corroborar el diagnóstico de leucemia mieloide crónica (LMC) para la que se designan valores muy bajos o nulos. Su determinación es muy útil para establecer el diagnóstico diferencial entre LMC y reacciones neutrofílicas secundarias que cursan con valores elevadísimos.
Fosfatasa ácida
Es una enzima hidrolítica perteneciente al grupo de las fosfomonoesterasas, que actúa sobre los ésteres del ácido fosfórico; su pH óptimo de actuación oscila entre 4,7 y 5,5. Se trata de una enzima de ubicación lisosómica.
La demostración citoquímica se basa en la hidrólisis del substrato naftol-AS-Bi-fosfato, liberándose unos productos intermedios que al combinarse con una sal diazoica dan un precipitado de color rojo anaranjado en el citoplasma.
La aplicación práctica del estudio de la fosfatasa alcalina se refiere sobre todo a los SLPC y LAL, dónde existe una buena correlación entre el tipo de positividad y el fenotipo de membrana. El 90% de las LAL de origen T dan una reacción positiva intensa de localización centrosómica; y las de tipo B o no-T-no-B suelen ser negativas. La LLC-T y otros SLPC T suelen cursar con valores elevados de FA que es tartrato sensible. La LLC-B presenta muy escasa actividad al igual que ocurre con otras proliferaciones de linfocitos B.
La tricoleucemia (o leucemia de células peludas es un síndrome linfoproliferativo crónico de células B) es un proceso linfoproliferativo en que el estudio de la FA ofrece un particular interés por cuanto la actividad enzimática a pesar de ser una célula linfoide es difusa, intensa y tartrato resistente. Se utiliza para demostrar la isoenzima 5 en el tricoleucocito.
De todas formas, con el advenimiento de los anticuerpos monoclonales, la técnica citoquímica en el estudio de los síndromes linfoproliferativos crónicos ha perdido predicamento.
Esterasas
Son un grupo de enzimas lisosomales presentes en cantidades variables en muchas células sanguíneas. Ellas hidrolizan ésteres orgánicos y liberan el alcohol (naftol), el cual se acopla a una sal diazoica para formar un azocolorante que se deposita sobre el sitio de actividad enzimática. Existen diferentes variedades según el substrato empleado.
Se utilizan 4 substratos: naftol-AS-C-cloroacetato, naftol-AS-D-acetato, alfa-naftil-acetato, alfa-naftil-butirato, los cuales al ser hidrolizados en presencia de una sal diazoica dan un precipitado insoluble en el lugar de la reacción.
Las esterasas específicas (cloroacetatoesterasa o CAE) usan el sustrato naftol-AS-D cloroacetato y su actividad se atribuye a las isoenzimas 1, 2,7 y 8. Las esterasas inespecíficas representan las isoenzimas 3, 4,5 y 6 y pueden usar varios sustratos: naftol AS-D acetato, alfa naftil acetato y alfa naftil butirato. El fluoruro de sodio es un potente inhibidor de las esterasas monocíticas.
Utilizando como substrato el naftol-AS-C-cloroacetato (CAE) se detecta una esterasa que es específica de la granulopoyesis neutrófila en la que es positiva a partir del mieloblasto y se expresa en forma de un precipitado rojo anaranjado muy brillante. Su utilidad diagnóstica se centra básicamente en el reconocimiento de células blásticas mieloides, si bien su aparición es más tardía que la de la mieloperoxidasa, aunque iguala a ésta en especificidad.
Utilizando como substrato el naftol-AS-D-acetato, se obtiene una intensa positividad en la serie monocítica que, a diferencia de las restantes células hematopoyéticas, es fluoruro sensible. Dada su positividad más restrictiva es preferente usar el substrato a -naftil-acetato o a -naftil-butirato para marcar la serie monocítica y sus precursores, cuya positividad es intensa y se manifiesta en forma de un precipitado difuso por todo el citoplasma.
Azul de toluidina (metacromasia)
La característica principal de los gránulos de los polimorfonucleares basófilos es su metacormasia con los colorantes azules, la cual consiste en que estos gránulos adquieran un color rojizo en presencia de estos colorantes. La metacromasia se debe a la gran riqueza en mucopolisacáridos ácidos sulfatados que poseen gránulos basófilos.
Con esta tinción se pueden detectar los componentes basófilos de los elementos hematopoyéticos y de células cebadas o mastocitos.
Utilidad clínica
Las reacciones de esterasas sirven para diferenciar la leucemia monocítica aguda de la mielomonocítica.
La reacción de PAS resulta útil para diferenciar las enfermedades linfoproliferativas benignas y malignas; para identificar las células eritroides anormales de la eritroleucemia; para identificar la célula de Sésary (Leucemia prolinfocítica T, células con núcleo cerebriforme).
El índice de fosfatasa alcalina sirve para discernir las reacciones leucemoides granulocíticas de la leucemia granulocítica crónica.
Diferencian los bastones de Auer de otras inclusiones cristalinas (son esterasa positivos, LMA).
Las reacciones de fosfatasa ácida sirven como marcadores para las células vellosas de la reticuloendoteliosis leucémica.
Descripción del método
- Realización de una extensión de médula ósea. Nota: La muestra debe ser enviada inmediatamente al laboratorio una vez extraída.
- Fijación de la extensión: Evita el deterioro celular al preservar las estructuras y reactividad funcional celulares evitando fenómenos nocivos para las mismas e impidiendo también la difusión de componentes bioquímicos entre los diferentes compartimentos celulares, así como al medio extracelular.
Se puede realizar con un gran número de sustancias fijadoras como: metanol, etanol, acetona, que actúan coagulando las proteínas celulares, así como el formaldehído y glutaraldehído, que actúan formando puentes intra e inter proteicos, de manera que se altera menos la estructura celular. Es importante eliminar bien todos los restos de fijador para evitar interacciones con el compuesto que se desea analizar. - Incubación en el medio de reacción: Al poner en contacto las células con el medio de reacción se liberan unos productos que, bien por sí mismos o bien combinados con otros, dan lugar a un precipitado apreciable al microscopio óptico. En el caso de identificación de enzimas se debe controlar bien el pH y la temperatura para optimizar la reacción.
- Tinción de contraste: Se realiza para facilitar la identificación morfológica de la célula en la que se ha producido la reacción ya que permite resaltar en lo posible el producto de reacción y permite una óptima visualización del núcleo y del citoplasma.
Las reacciones deben tener sensibilidad, especificidad y reproducibilidad.
Valores de referencia
Tabla 1. Citoquímica de las leucemias mieloides.
Tabla 2. Citoquímica de las leucemias linfoides agudas.
Interpretación de los resultados
La interpretación del resultado corre a cargo de los médicos del laboratorio de Morfología del Servicio de Hematología. Se realizará un informe de las células observadas en un recuento, expresándose como porcentaje y se realizará un informe interpretativo de la exploración. Es un resultado de positividad o negatividad para la técnica citoquímica que sea de aplicación.
El tiempo de respuesta es de tres días laborables desde la recepción de la muestra en el laboratorio. Puede ser necesario aumentar este periodo en casos especialmente complicados o que requieran técnicas adicionales.
Bibliografía
- Vives Corrons J.L., Aguilar Bascompte J.P, Colomer D, Foncuberta J, Muñiz E, Nonmededéu Josep, Solé F, Villamor N. Manual de Técnicas de Laboratorio en Hematologia 4 ª Edición.2015
- Boyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of mononuclear cells by one centrifugation and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation. Scan J Clin Lab Inves 1968; 97:77-89.
- Glasser L, Fiederlein RL. Neutrophil migration under the agarose. Am J Clin Pathol 1979; 72:956-62? International Committee for Standardization in Haematology. Recommended methods for cytological procedures in hematology. Clin Lab Haematol 1985; 7:55-74.
- Parry RM, Chandon RC, Shahani RM. A rapid and sensitive assay of muramidase. Proc Soc Exp Biol 1965; 119:384.
- Park B, Firkis SM, Smithwich EM. Infection and nitroblue tetrazolium reduction by neutrophils. Lancet 1968; 2:532.
- Scott CS, Den Ottolander GJ, Swirsky D, Pangalis GA, Vives Corrons JL, De Pasquale A, et al. Recommended procedures for the classification of acute leukemia’s. Leuk Lymphoma 1993; 2:37-49.
- Scott CD, Ottolander GJ, Swirsky D, Pangalis GA, Vives Corrons JL, De Pascuale A, et al. International Council for Standarization in Haematology. Recommended Procedures for the Classification of Acute Leukaemias. Leuk Lymphoma 1993; 11:37-50.
- Woeesner S, Florensa L. La citología óptica en el diagnóstico hematológico. 5. ª ed. Madrid: Acción Médica-FEHH; 2006.
- Hayhoe FGJ, Quaglino D. Haematological Cytochemistry. 2.ª ed. Edinburgh: Churchill Livingstone; 1990.
- Hotchkiss RD. A microchemical reaction resulting in the staining of polysacharide structures in fixed tissue preparations. Arch Biochem Biophys 1948; 16:131.