Enzimas en el laboratorio

Incluido en la revista Ocronos. Vol. V. Nº 11–Noviembre 2022. Pág. Inicial: Vol. V; nº11: 106

Autor principal (primer firmante): Nayua Mohamed Amar

Fecha recepción: 18 de octubre, 2022

Fecha aceptación: 14 de noviembre, 2022

Ref.: Ocronos. 2022;5(11) 106

Autoras: Nayua Mohamed Amar & Elena Sánchez Contreras

Categoría Profesional: Técnico Superior de Laboratorio

Introducción

Las enzimas son el grupo más variado y especializado de las proteínas. Su función es actuar como catalizadores y permitir que las reacciones que tienen lugar en los seres vivos se desarrollen a un ritmo adecuado. Todas las reacciones químicas están catalizadas por enzimas. Podemos definir un catalizador como un compuesto que con su sola presencia aumenta la velocidad de la reacción sin experimentar ninguna alteración. Las enzimas pueden acelerar reacciones químicas específicas en un medio acuoso y en condiciones en las que los catalizadores no biológicos serían incapaces de realizar iguales funciones.

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La enzimología clínica es la aplicación del conocimiento de las enzimas en el diagnóstico, tratamiento y pronóstico de la enfermedad.

La enzimología es una parte fundamental de la química clínica ya que la determinación de enzimas en el laboratorio suele ser una de las pruebas más requeridas en la práctica diaria. La determinación de una enzima o un grupo de enzimas en el plasma sanguíneo o en otro líquido biológico, puede proporcionarnos una información muy valiosa a cerca del tejido o células de las que provienen las enzimas detectadas en el laboratorio.

Estructura de las enzimas

Las enzimas son macromoléculas de origen proteico de elevado peso molecular compuestas por átomos de carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno y azufre.

Las enzimas están formadas por una secuencia específica de aminoácidos que constituyen de este modo la estructura primaria de las enzimas. Los aminoácidos de la cadena están unidos entre sí por enlaces peptídicos adquiriendo así la cadena una estructura tridimensional que puede disponerse de tres formas diferentes: alfa-hélice, hoja beta-plegada y espiral (estructura secundaria).

La estructura terciaria viene determinada por la capacidad de la estructura secundaria de plegarse sobre sí misma. Cada proteína adquiere una estructura terciaria propia que le confiere las propiedades biológicas específicas y exclusivas de cada tipo de enzima. Las cadenas polipeptídicas de la estructura terciaria pueden unirse entre sí determinando la estructura cuaternaria.

Estas cuatro estructuras van a determinar la actividad catalítica de una enzima y su estabilidad está en función de parámetros tales como la temperatura, la concentración de hidrógeno (pH) y la concentración de sales del medio en que se encuentre.

En realidad, la parte más importante de la estructura de una enzima es la denominada sitio activo y que es el lugar por donde se une al sustrato para que la enzima pueda llevar a cabo su función catalizadora. El resto de la molécula cumple la mera misión de soporte estructural para que los componentes del sitio activo se mantengan en la conformación espacial adecuada para que la enzima pueda cumplir su misión catalítica.

Función de las enzimas

Las enzimas son biomoléculas cuya función en nuestro organismo es la de actuar como catalizadores de las reacciones químicas que tienen lugar en él sin sufrir modificación en el proceso. Por lo tanto, lo que consiguen es aumentar la velocidad a la que estas reacciones se producen.

Para ello la enzima debe reaccionar con algún material: el sustrato que tras la reacción se transforma en producto.

Las enzimas tienen una serie de propiedades que podemos resumir:

  • Son eficaces en muy pequeñas cantidades.
  • No se alteran con la reacción.
  • Solo van a afectar con la que se alcanza el equilibrio de la reacción.
  • Poseen mayor especificidad que los catalizadores químicos habituales.

Las enzimas llevan a cabo su función bien de forma solitaria o bien mediante un complejo llamado holoenzima, formado por la enzima propiamente dicha o apoenzima más un cofactor. Este cofactor puede ser de naturaleza metal orgánica, en cuyo caso lo llamamos activador enzimático, o bien ser moléculas orgánicas, denominadas coenzimas.

La especificidad de las enzimas no es específica, esto quiere decir que enzimas diferentes pueden catalizar una misma reacción química. A estas se les conoce como isoenzimas. El uso de las isoenzimas como marcadores específicos de lesión tisular, celular o subcelular, como por ejemplo la creatinina quinasa (CK) y sus isoenzimas CK-MB, CK-BB y CK-MM, es lo que en realidad nos interesa a diario en la práctica en el laboratorio.

Cinética de las reacciones enzimáticas

La acción de las enzimas es absolutamente necesaria para los sistemas vivos ya que las reacciones sin catalizar son lentas y las posibilidades que tiene una molécula de cambiar en un ambiente estable como es el medio biológico, son muy bajas, de ahí que las enzimas proporcionen el medio adecuado para contrarrestar la lentitud en la reacción del cambio.

La forma que tiene la enzima de realizar su actividad catalítica será en primer lugar unirse con el sustrato y, en segundo lugar, facilita la modificación del mismo para su cambio a producto. Las enzimas reaccionan ofreciendo su sitio activo al sustrato con el cual se acoplan y forman el complejo enzima-sustrato donde actúa con gran rapidez hasta liberar el producto transformado sin que esta reacción se altere la enzima, la cual queda libre para fijar otra molécula de sustrato.

Dentro de todo el conjunto de enzimas, las hay que presentan una alta especificidad, es decir, solo aceptan un tipo de moléculas sobres las que realizar la catalización. Otras, por el contrario, son menos específicas y catalizan reaccionan utilizando como sustratos moléculas que presentan una cierta similitud.

La interacción entre enzima y sustrato se realiza a través de enlaces de naturaleza débil entre la molécula de sustrato y el centro activo. Cuanto mayor sea el número de estos enlaces, mayor será la especificidad de la enzima.

El estudio de la actividad enzimática implica el análisis de la velocidad de actuación de la enzima, lo cual se conoce como cinética enzimática. La velocidad de catálisis de una enzima se determina bien como velocidad a la que se forma el producto, o bien como velocidad a la que desaparece el sustrato.

Si mantenemos contantes las condiciones de la reacción (pH, temperatura, cofactores y concentración de enzima), la velocidad aumenta a medida que aumentamos la concentración de sustrato, hasta llegar a un punto (velocidad máxima) a partir del cual la velocidad es constante, aunque siga aumentando la concentración de sustrato. Esto se explica porque al aumentar mucho la cantidad de sustrato, la enzima se satura, y es entonces cuando se alcanza la mayor velocidad de reacción posible, que va a depender exclusivamente del tiempo que necesite la enzima para transformar el sustrato.

En 1913, Michaelis y Menten diseñaron un modelo o teoría general de la acción enzimática que explica el comportamiento de la velocidad de reacción con respecto a la concentración de sustrato.

Cuando se estudia la actividad enzimática, se observa que, a bajas concentraciones de sustrato, la velocidad es una función lineal de la cantidad de sustrato. A este fenómeno se le llama cinética de primer orden. Si la concentración de sustrato sigue aumentando, llega un momento en que la velocidad es independiente de la concentración de sustrato. En este caso se dice que es una cinética de orden cero.

Cuando tiene lugar la reacción enzimática, el producto formado aumenta proporcionalmente con la concentración de enzima hasta que esta excede la cantidad de sustrato disponible, y se agota todo el sustrato antes de que finalice la monitorización de la reacción. En este momento, la reacción deja de ser lineal y y no refleja la actividad enzimática. Esto es lo que denominamos el límite lineal en una determinación enzimática.

Técnica de análisis

El estudio enzimático en el laboratorio se base de una forma general en la demostración in vitro de la actividad catalítica que tienen in vivo. Por lo tanto, lo que en realidad nos interesa determinar es la funcionalidad de la enzima. La actividad de una enzima se mide mediante la determinación de la cantidad de sustrato transformado por unidad de tiempo, en condiciones exactamente definidas y estrictamente controladas. Existen pruebas específicas para hacer estas mediciones basadas en métodos inmunológicos, electroforéticos, cromatográficos y otros, que se emplean para el estudio de las distintas isoenzimas que componen la enzima o para aislar la forma de la enzima.

Los métodos más comunes son:

  1. Métodos cinéticos colorimétricos. Se basan en la confirmación de un aumento del producto formado o de la reducción del sustrato mediante reacciones colorimétricas.
  2. Métodos cinéticos con NADH O NADPH. El fundamento se apoya en el hecho de que las formas reducidas de las coenzimas NADH y NADPH absorben la luz ultravioleta a una longitud de onda de 340 nm., y las formas oxidadas de estas coenzimas no lo hacen a esta longitud de onda.

Enzimas plasmáticas. Determinaciones más frecuentes

1. Fosfatasas. Pertenecen a la clase de las hidrolasas y a la subclase de las estresas. Dentro de ellas se incluyen dos enzimas principales:

  • Fosfatasa alcalina. Enzima intracelular que se encuentra en todos los tejidos, tiene cuatro isoenzimas, derivadas del hígado, hueso, intestino o placenta.
  • Fosfatasa ácida. Tiene varias isoenzimas y está presente en numerosos tejidos tales como el hígado, bazo, riñón, eritrocitos, plaquetas y osteoblastos, pero donde se encuentra en mayor proporción es en la glándula prostática (la más importante, ya que se determina en laboratorio como marcador tumoral en los carcinomas metastásicos de la próstata).

2. Creatinina quinasa. Es una transferasa que cataliza el ATP requerido por los sistemas contráctiles o de transporte. También cataliza la fosforilación reversible de la creatinina, siendo el ATP el dador del grupo fosfato. Se trata de una enzima mitocondrial y citoplasmática ampliamente distribuida por los tejidos, pero en distinta concentración y de forma decreciente en músculo esquelético, miocardio, placenta y cerebro, y en menor proporción en otros tejidos. Se encuentra formada por dos subunidades: M y B, que se combinan formando tres isoenzimas: CK-MB, CK-BB y CK-MM.

3. Aminotransferasas o transaminasas. Catalizan la reacción reversible de un grupo alfa-amino de un aminoácido a un alfa-cetoácido. Dentro de la clasificación de las enzimas, pertenecen a la segunda clase, las transferasas y existen dos clases:

  • Aspartato aminotransferasa (AST). Existe una forma mitocondrial (la más importante y que constituye el 81% de la enzima total presente en el hígado humano) y una forma citoplasmática soluble en menos cantidad. Se presenta en el corazón, hígado, músculo esquelético y riñón.
  • Alanina aminotransferasa (ALT). Cataliza la transferencia de un grupo amino de la L-alanina al alfa-cetoglutarato. Y se encuentra en mayor cantidad en forma de enzima citoplasmática soluble en el hígado y en menos concentración en miocardio y otros tejidos.

4. Gamma Glutamil Transferasa. Cataliza la transferencia de un grupo gamma-glutamilo o un aminoácido o péptido a otra molécula de sustrato o al agua. Se encuentra principalmente en el riñón, páncreas, hígado y próstata. Es una enzima microsómica, por lo que el alcohol y algunos fármacos son capaces de producir una inducción enzimática y aumentar sus niveles séricos.

5. Lactato Deshidrogenasa. Cataliza la acción reversible de lactato a piruvato. Es más abundante en miocardio, riñón, hígado y músculo si bien se encuentra ampliamente distribuida por los tejidos. Es un tetrámero compuesto por cuatro subunidades. Existen dos subunidades diferentes: H (para las cadenas de péptidos del corazón) y M (para las cadenas del músculo liso).

6. Amilasa. Es la encargada de degradar las moléculas de carbohidratos complejos en componentes más pequeños. La producción de amilasa es llevada a cabo por el páncreas exocrino y las glándulas salivares para facilitar la digestión del almidón. Es filtrada con facilidad por los glomérulos renales debido a su bajo peso molecular por lo que es no es de extrañar su presencia en orina cuando se encuentra aumentada en suero, como ocurre en el caso de la pancreatitis.

Relación entre las enzimas y algunos procesos patológicos

Una vez que conocemos cuales son las principales enzimas y sabemos cómo actúan, procedemos a establecer la relación entre ellas y algunos procesos patológicos en los cuales se ven implicadas.

 1. Infarto de miocardio. El dato fundamental es la elevación de la concentración de enzimas plasmáticas y las más frecuentes son: la creatinfosfoquinasa (CPK), la transaminasa glutámica oxaloacética (TGO) y la deshidrogenasa láctica (DHL).

 La enzima que se eleva más tempranamente es la CPK y su isoenzima la CK-MB, que lo hacen en las primeras 8 horas alcanzando su pico máximo alrededor de las 24 horas y regresando a sus cifras normales a los 2 o 3 días.

 la TGO se eleva más tarde y se mantiene elevada durante más tiempo. Presenta el pico máximo a las 48 horas y se normaliza hacia el quinto día.

 La DHL se eleva en suero a las 24 o 48 horas siendo su elevación más sostenida que las anteriores. Alcanza su pico máximo a los 4 o 6 días descendiendo a cifras normales en una o dos semanas después del infarto.

 2. Pancreatitis aguda. La autólisis del parénquima del páncreas exocrino libera lipasa y amilasa al tejido intersticial, que pasan de los vasos linfáticos a la circulación sanguínea. Como tienen un peso molecular relativamente bajo atraviesan el glomérulo renal. Los túbulos reabsorben la lipasa, pero no la amilasa, que aparecerá en elevadas concentraciones en orina. Por ello, en el diagnóstico de la pancreatitis se determinan lipasa en sangre y amilasa en sangre y orina.

 3. Hígado y enzimas séricas. Las enzimas liberadas por las células hepáticas son vertidas directamente a la sangre, por lo que pueden ser detectadas en un plazo de tiempo muy corto desde la lesión.

 El uso de exámenes de laboratorio automatizados ha hecho posible la identificación de muchos pacientes, en gran parte asintomáticos, con elevación de enzimas hepáticas. La elevación de estas enzimas y la alteración de otras pruebas de laboratorio como la albúmina o el tiempo de protombina, son fundamentales para el diagnóstico de un trastorno hepático en cualquier individuo, y por lo tanto se debe iniciar una evaluación más profunda.

 4. Hepatitis víricas agudas. Se puede constatar la elevación de la ALT en mayor proporción que la AST. La elevación de los niveles séricos de estas enzimas no es directamente proporcional a la gravedad del daño hístico. En las hepatitis agudas también se produce una elevación de la GGT.

 Las enzimas séricas se normalizan en un plazo de 3 a 5 semanas.

 En las situaciones de hepatitis fulminante, los niveles séricos de transaminasas van a descender de forma brusca debido a que la necrosis generalizada de las células hepáticas va afectando a todo el parénquima hepático perdiendo este su funcionalidad y, por tanto, su capacidad de producir más  enzimas y liberarlas al medio.

 Si la hepatitis se hace crónica, las enzimas no llegan a normalizarse.

  5. Enzimas marcadoras de alcoholismo. Las determinaciones de GGT en plasma como marcador sensible y precoz es de gran utilidad para llegar a un diagnóstico de etilismo crónico. El alcohol actúa como inductor enzimático y como tóxico. Por este motivo, cuando se abandona el hábito alcohólico, se produce una disminución exagerada de la actividad enzimática hasta la vuelta a la normalidad.

  6. Cirrosis hepática. En esta patología hay un incremento moderado de las transaminasas, siendo el incremento de AST mayor que el de ALT, al contrario de lo que ocurría en la hepatitis vírica aguda.

 Si la cirrosis es de origen etílico, también se encontrará aumentada la GGT, y si es de origen biliar, lo estarán de forma clara las fosfatasas alcalinas.

Bibliografía

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